日前(1月30日),由諾貝爾獎得主Jennfer Doudna共同創辦的Mammoth Biosciences,發表了一種體積僅有Cas9蛋白三分之一的新型CRISPR核酸酶「NanoCas」,不僅能在單顆腺相關病毒(AAV)載體中塞入更多載荷(payload),也在小鼠、猿猴實驗中證明能將體內基因編輯的應用從肝臟擴及到其他部位,例如肌肉,有望應用在肌肉失養症的治療。這項成果發表在預印本平台《bioRxiv》。
在基因體學藥物開發上,如何將基因編輯系統精準遞送到患者體內、針對目標基因執行編輯,仍相當具有挑戰性。其中,基因編輯系統使用的Cas蛋白體積是一項重大挑戰,因為第一代的CRISPR系統,包括Cas9和Cas12a,對於現行佔據主流地位的AAV載體來說依然太大,難以執行有效地體內遞送。
目前產學界的做法,主要是透過體外基因工程修飾細胞後,再將完成基因編輯的細胞送入患者體內。例如2023年12月獲批准的Casgevy,就是先從患者的骨髓和血液中蒐集造血幹細胞、加以編輯,再輸注回患者體內。
而現有的體內基因編輯技術,主要仍以肝臟為目標部位,因為肝臟針對病毒載體、或是奈米脂質微粒(LNP)等基因編輯遞送系統具有較高的吸收能力,也更容易累積,便於將遺傳載荷送進目標細胞。
NanoCas:體積僅有1/3,更容易塞進病毒載體
此次Mammoth發表的新型Cas酵素——NanoCas,體積僅有Cas9的三分之一,能夠在容納進單顆AAV載體的同時,還有多餘的空間容納其他載荷,例如:調節元件(regulatory elements)、引導RNA(guide RNA)、雙單股切割編輯系統(non-double strand break editing machinery)等。
研究團隊表示,這項特性使得NanoCas能夠廣泛應用在多種基因編輯模態(modalities)中,例如:逆轉錄酶編輯(reverse transcriptase editing)、鹼基編輯(base editing)、表觀遺傳學編輯(epigenetic editing)等。
Mammoth的研究團隊從總體基因體(metagenomics)數據庫中,篩選出176種超壓縮CRISPR系統,再運用蛋白質工程技術,增加NanoCas的編輯效率。藉由動物模型實驗,研究團隊證明NanoCas能在單顆AAV載體運送下,在各種細胞系統和體內組織中,展現充分的體內基因編輯能力。
首先,研究團隊將NanoCas應用在老鼠體內肝臟編輯,將PCSK9基因作為遞送載荷。結果顯示,NanoCas展現出與SaCas9相近的60%編輯率,且成功將血中PCSK9蛋白降低到無法偵測的濃度。
研究團隊也將NanoCas用在裘馨氏肌肉失養症(DMD)的人源化小鼠模型上,針對肌失養蛋白(dystrophin)的編碼基因達成10%~40%的編輯率,作用部位包含股四頭肌、小腿肌、心肌等。
最後,NanoCas在靶向食蟹猴(cynomolgus macaques)骨骼肌中的肌失養蛋白時,展現出高達30%的編輯率,此外在心臟的編輯效率也有15%,相較之下SaCas9只有10%。此外,肝臟分析也顯示NanoCas的脫靶編輯(off-targeting editing)的發生率變得更低。
Mammoth共同創辦人暨執行長Trevor Martin表示,肝臟之外的體內編輯一直是基因編輯領域的挑戰,NanoCas尺寸更小的特性,讓它能和廣泛的基因編輯模組搭配,且放在單一AAV載體之中就能達成。這對於在體內編輯的目標而言,是重大的一步。
延伸閱讀:10位CRISPR新生代科學家 領航基因編輯下一個10年
參考資料:
https://www.genengnews.com/topics/genome-editing/aav-delivered-nanocas-crispr-system-edits-muscle-in-non-human-primates/
原始研究:
https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2025.01.29.635576v1
(編譯 / 吳培安)