美國時間11月13日，哈佛大學臺裔美國科學家劉如謙團隊開發了一套定向演化(directed evolution)系統，成功研發出第五代(v5)工程化類病毒顆粒(eVLP)。相較於第四代(v4)，v5 eVLP擁有更高的核糖核蛋白(RNP)包裝能力、更優異的遞送與釋放效果，以及獨特的衣殼(capsid)結構。研究顯示，v5 eVLP在哺乳動物細胞中的遞送效率是v4 eVLP的2~4倍。該成果發表於《Nature Biotechnology》期刊。
 
在研究中，團隊開發了一套專為eVLP設計的定向演化系統，利用條碼化的嚮導RNA (guide RNA, gRNA)裝載於無DNA (DNA-free)的eVLP貨物(cargo)中，為每種變體進行標記。透過篩選，成功找到具目標特性的候選者，大幅提升eVLP的生產與遞送效率。
 
研究發現，大多數衣殼突變體的生產與遞送效率不及標準v4 eVLP衣殼。不過，有少數突變體在生產或遞送方面表現出提升的跡象。但沒有任何突變體能同時在這兩方面都表現優秀，這說明eVLP的生產和遞送效率可能受不同且相互影響的機制控制。
 
為了達到生產與遞送效率的雙重條件，研究團隊選出改善單一特性而不損害另一特性的突變體。結果顯示，適度提升產量的突變體比大幅提升產量的突變體在效力上表現更佳，說明過度提升eVLP產量或包裝能力會不利於eVLP的整體性能。
 
研究團隊透過結合有益突變，使v5 eVLP在相同基因編輯效率下所需劑量僅為v4 eVLP的二分之一至四分之一。這使v5 eVLP在受最大劑量限制的遞送應用中展現了更大的潛力。
 
團隊還研究了衣殼突變對v5 eVLP的影響。其中，蛋白質Q226P突變可能改變其裂解速率，改善大型 RNP貨物的包裝效率；C507V突變則破壞CCHC鋅指基序(zinc-finger motif)，影響病毒基因組的複製，進一步優化eVLP衣殼以適應非天然RNP貨物的包裝需求。
 
研究顯示，與v4 eVLP相比，v5 eVLP顆粒上含有更多活性RNP，有助於遞送效率提升。此外，v5 eVLP與單一條碼gRNA和單一標準gRNA均相容，表明其活性不依賴單一條碼gRNA的使用。
 
研究團隊利用冷凍電子顯微鏡(cryo-EM)技術，分類了所有觀察到的eVLP衣殼結構。文獻指出，未成熟的衣殼在醣胺聚醣(gag)蛋白水解加工前形成單層球形結構，而成熟衣殼經水解後轉變為多層不規則多面體結構。
 
結果顯示，v5 eVLP突變導致衣殼結構顯著改變，未觀察到典型的成熟衣殼形態，表示突變可能干擾了衣殼正常結構重組過程。此外，在冷凍電鏡影像中，v5 eVLP的平均直徑為137±0.87 nm，略大於v4 eVLP的131±1.06 nm。這一尺寸的增加可能使v5 eVLP容納更多貨物分子，有助於其效力提升。
 
綜上所述，條碼化eVLP的定向演化系統為開發更高效的eVLP提供了新可能，展現了廣泛應用潛力。
 
參考資料: https://mp.weixin.qq.com/s/ZgejqFKImVnj_XmccsqVgg
論文: https://www.nature.com/articles/s41587-024-02467-x
 
(編譯/黃佳啟)