日前，現任白宮科學首席顧問、前美國國家衛生研究院(NIH)院長Francis Collins，發表其研究團隊在NIH國立人類基因體研究所(NHGRI)進行，將先導編輯(prime editing)應用在誘導型多潛能幹細胞(iPS細胞)生成特定的單鹼基變異，以進行第二型糖尿病(T2D)的研究應用。這項研究發表在《The CRISPR Journal》。
 
NHGRI長期關注T2D，以及新型精準基因體編輯的應用，例如使用鹼基編輯(base-editing)，來治療早衰症的小鼠模型。而在這項研究中，Collins的研究團隊改良了先導編輯的實驗操作流程，進而以幹細胞工程產出了27個iPS細胞株，其攜帶了異型合子和同型合子的對偶基因，並可對應6種與T2D風險相關的因果性(causal)單核苷酸變異。
 
研究團隊表示，此操作流程的基因編輯效率可達36%，在某些細胞株甚至可高達70%。這種改良版的操作流程，也讓科學家只需4到5週，便可以完成從iPS細胞株的先導編輯元件轉染，到取得經過確效、準備好用於研究的多潛能細胞。
 
研究團隊指出，過往的研究已經將一些環境及遺傳因子，連結到T2D的病程發展。有些大型的關聯性研究，發現了數百個與糖尿病有關的遺傳變異，關聯數超過1200個。然而，哪些關聯具有因果性、哪些只是搭便車(along for the ride)目前還不清楚。此外，個體遺傳背景的差異，也提高了找出最重要/最優先變異的困難度，而先導編輯則能有效率地回答這些問題。
 
Collins的研究團隊利用先導編輯，對DNA進行了精準編輯，並探索了這些變化和特定表型的關聯。例如，他們能夠在三個不同iPS細胞株的同一位點上執行三次編輯，將其分化成beta細胞，接著評估表型上個別的變化。
 
事實上，Francis Collins研究室在利用先導編輯於iPS細胞株改變單基因的研究，克服了一些長期以來的技術挑戰。例如，他們使用不同的先導指引RNA (pegRNA)和單股指引RNA (sgRNA)的組合來修飾鹼基，嘗試用各種方法將編輯工具送進細胞、使它們能在細胞內自我複製，也重新設計了pegRNA以讓它們更有效。
 
此外，他們的操作流程也包含了多重定序步驟，目的是確認編輯程序的效率。特別是在轉染步驟後，先利用次世代定序，從細胞堆中篩選出對偶基因編輯程度最高的細胞，再利用桑格定序(Sanger sequencing)找出帶有正確編輯成有興趣結果的細胞株。最後他們從數百個中挑出六個變異細胞株，這些細胞株帶有基於現有研究結果、推測出最可能具有T2D因果性的變異。
 
第一作者、NHGRI分子遺傳學部門專職研究員Lori Bonnycastle表示，他們的概念是挑出最好的細胞、深層探究它們、再將帶有基因編輯的細胞株培養出來。然而，由於先導編輯還在發展早期，還有許多因素需要考量，且流程中也有許多點可能會出錯，或是編輯元件可能不會有效運作。例如，欲進行編輯的鹼基周圍的序列種類，有時候也會侷限編輯工具的效率。
 
此外，研究團隊僅是在一種轉染設計下，改良不同的先導編輯系統元件和pegRNA設計編輯效率，一旦達到可接受的編輯效率，就停止測試組合，並沒有測試所有可能的實驗參數變異，因此可能不是每種先導編輯參數測試都能據此產生最佳效果。
 
參考資料：
https://www.genengnews.com/topics/genome-editing/prime-editing-opens-up-new-avenues-for-studying-type-2-diabetes-other-diseases/
 
(編譯 / 吳培安)