美國時間5日，加州大學柏克萊分校(UC Berkeley)、舊金山分校(UCSF)組成的聯合研究團隊，在最新一期《Nature Chemical Biology》中發表一套串聯兩種CRISPR酵素反應的新穎病毒檢測法，不須經過RNA擴增步驟，只要20分鐘就能偵測到病毒RNA，且靈敏度高達每微升31個RNA副本(copy/μl)。

目前新冠肺炎檢測的黃金標準，是即時定量聚合酶連鎖反應(qRT-PCR)。其靈敏度非常高，可達到1 copy /μl，但操作需要特定儀器花上數小時執行，也需要中心化的實驗室設施處理，因此整套檢測流程通常需要花上1~2天；此外，病毒RNA擴增的過程會產出數以十億計的RNA副本，很容易在不同的患者樣本之間造成交叉汙染。

因此，研究團隊的目標是開發出不須RNA擴增步驟，就能比qRT-PCR更快速、操作更簡單的檢測。目前他們開發出來的檢測法，可在20分鐘完成，且靈敏度可達到31 copy/μl。雖然仍低於qRT-PCR，但已經足以監測人群感染、限制感染擴散，且已經驗證可在簡便的微流體裝置上執行，有助於定點檢測的開發。
 

結合兩種CRISPR酵素 更快、更低成本完成RNA病毒檢測

這項不須擴增步驟就能偵測病毒RNA的創新技術，是從去年4月全球新冠肺炎大流行期間，由UC Berkeley的分子生物學教授David Savage擔任研究主持人(principal investigator)，再加上諾貝爾獎得主Jennifer Doudna、知名台裔科學家徐安祺(Patrick Hsu)等共計7個研究團隊聯合參與研究。

該技術的名稱為「FIND-IT」，全名為「聯合快速整合核酸酶檢測」(Fast Integrated Nuclease Detection In Tandem)。它串聯了兩種不同的Cas酵素——負責偵測特定RNA的Cas13酵素，以及用來擴增螢光訊號的Csm6酵素。

Cas13是一種通用型CRISPR酵素，能夠辨識特定RNA序列、並執行剪切程序，進而釋放出帶有螢光的報導分子(reporter molecule)，但如果只有Cas13本身，將需要好幾小時才能產生足以被偵測到的螢光訊號。

因此，研究團隊另外設計一種可充當活化劑(activator)角色的寡核苷酸(oligonucleotide)序列，並和後續的Csm6酵素反應串聯起來。當Cas13酵素偵測到病毒RNA時，這種活化劑也會被Cas13切割，切割出的特定碎片能作為擴增訊號，使Csm6去切割帶有螢光分子的RNA片段，繼而產生大量的螢光訊號。

此外，由於這種活化劑在一般狀況下很快就會被Csm6降解、影響到後續螢光訊號的生成，因此研究團隊在活化劑加上化學修飾，使其能夠促使Csm6反覆執行剪切、釋放出螢光報導分子，將靈敏度提升了100倍。

帶領研究團隊、來自Doudna實驗室的研究員Tina Liu說明，當RNA目標被Cas13辨識出來時，所引發的不單單是Cas13的剪切能力，而是生成好幾倍的活化酵素，透過後續的剪切，產生更大量的螢光報導分子。

Liu表示，這種串聯核酸酶的方式，能讓所有元件整合成單一反應，且在攝氏37度下就能完成，因此不需要在實驗室內用專業儀器高溫加熱，也不需要多個步驟，不僅操作更快、更簡單，靈敏度還可和其他現有技術媲美，未來它的靈敏度甚至還能更高。

其後，研究團隊也將FIND-IT系統和微流體卡匣結合，加入從患者樣本中萃取出的病毒RNA，測試是否可在可攜式裝置上使用。經過驗證，在配置相機的小型裝置上，這套系統確實可以捕捉到新冠病毒RNA。

Liu也期待，這套快速、低成本的技術，將能成為定點照護(point of care)檢測的助力；此外，它的應用將不侷限於新冠肺炎，未來也能用在流感、愛滋病或任何RNA病毒引發的傳染病上。

參考資料：
https://news.berkeley.edu/2021/08/05/using-two-crispr-enzymes-a-covid-diagnostic-in-only-20-minutes/
研究原文：
https://www.nature.com/articles/s41589-021-00842-2

(編譯/吳培安)