美NIH前院長Francis Collins領軍 改良先導編輯iPS細胞株流程助糖尿病研究  

撰文記者 吳培安
日期2024-03-05
EnglishFrenchGermanItalianPortugueseRussianSpanish
美國前國家衛生研究院(NIH)院長、現任拜登政府科學顧問長Francis Collins。(圖片來源:NIH)

日前,現任白宮科學首席顧問、前美國國家衛生研究院(NIH)院長Francis Collins,發表其研究團隊在NIH國立人類基因體研究所(NHGRI)進行,將先導編輯(prime editing)應用在誘導型多潛能幹細胞(iPS細胞)生成特定的單鹼基變異,以進行第二型糖尿病(T2D)的研究應用。這項研究發表在《The CRISPR Journal》。
 
NHGRI長期關注T2D,以及新型精準基因體編輯的應用,例如使用鹼基編輯(base-editing),來治療早衰症的小鼠模型。而在這項研究中,Collins的研究團隊改良了先導編輯的實驗操作流程,進而以幹細胞工程產出了27個iPS細胞株,其攜帶了異型合子和同型合子的對偶基因,並可對應6種與T2D風險相關的因果性(causal)單核苷酸變異。
 
研究團隊表示,此操作流程的基因編輯效率可達36%,在某些細胞株甚至可高達70%。這種改良版的操作流程,也讓科學家只需4到5週,便可以完成從iPS細胞株的先導編輯元件轉染,到取得經過確效、準備好用於研究的多潛能細胞。
 
研究團隊指出,過往的研究已經將一些環境及遺傳因子,連結到T2D的病程發展。有些大型的關聯性研究,發現了數百個與糖尿病有關的遺傳變異,關聯數超過1200個。然而,哪些關聯具有因果性、哪些只是搭便車(along for the ride)目前還不清楚。此外,個體遺傳背景的差異,也提高了找出最重要/最優先變異的困難度,而先導編輯則能有效率地回答這些問題。
 
Collins的研究團隊利用先導編輯,對DNA進行了精準編輯,並探索了這些變化和特定表型的關聯。例如,他們能夠在三個不同iPS細胞株的同一位點上執行三次編輯,將其分化成beta細胞,接著評估表型上個別的變化。
 
事實上,Francis Collins研究室在利用先導編輯於iPS細胞株改變單基因的研究,克服了一些長期以來的技術挑戰。例如,他們使用不同的先導指引RNA (pegRNA)和單股指引RNA (sgRNA)的組合來修飾鹼基,嘗試用各種方法將編輯工具送進細胞、使它們能在細胞內自我複製,也重新設計了pegRNA以讓它們更有效。
 
此外,他們的操作流程也包含了多重定序步驟,目的是確認編輯程序的效率。特別是在轉染步驟後,先利用次世代定序,從細胞堆中篩選出對偶基因編輯程度最高的細胞,再利用桑格定序(Sanger sequencing)找出帶有正確編輯成有興趣結果的細胞株。最後他們從數百個中挑出六個變異細胞株,這些細胞株帶有基於現有研究結果、推測出最可能具有T2D因果性的變異。
 
第一作者、NHGRI分子遺傳學部門專職研究員Lori Bonnycastle表示,他們的概念是挑出最好的細胞、深層探究它們、再將帶有基因編輯的細胞株培養出來。然而,由於先導編輯還在發展早期,還有許多因素需要考量,且流程中也有許多點可能會出錯,或是編輯元件可能不會有效運作。例如,欲進行編輯的鹼基周圍的序列種類,有時候也會侷限編輯工具的效率。
 
此外,研究團隊僅是在一種轉染設計下,改良不同的先導編輯系統元件和pegRNA設計編輯效率,一旦達到可接受的編輯效率,就停止測試組合,並沒有測試所有可能的實驗參數變異,因此可能不是每種先導編輯參數測試都能據此產生最佳效果。
 
參考資料:
https://www.genengnews.com/topics/genome-editing/prime-editing-opens-up-new-avenues-for-studying-type-2-diabetes-other-diseases/
 
(編譯 / 吳培安)